Білім және ғылым министрлігі



жүктеу 1.01 Mb.

бет8/9
Дата22.04.2017
өлшемі1.01 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

2.6 Генді карталау
Генді карталау
 деп қажетті геннің қандайда бір хромосомадағы 
басқа гендермен салыстырғандағы орнын анықтауды айтады.
Генді  карталаудың  мақсаты  -   жануар  геномындағы  жекеле- 
ген  гендердің  молекулалык  ориентациясын  дэл  анықтау.  Гендік 
карталардың 
генетикалық
 жэне 
физикалыц
 түрлерін ажыратады.
Генетикалық  гендік  карталар
  дегеніміз  -   гендер  тіркесуінің 
(сцепление)  картасы,  яғни  тіркескен  гендердің  саны  мен  ДНҚ 
тізбегін  жэне  тіркесу  топтары  мен  олардыц  сызықтық  бағытыныц 
рекомбинация жиілігіне сай мәліметі. Рекомбинация дәрежесі екі ло- 
кус арасындағы кроссинговер уақиғасы (события) жиілігін білдіреді. 
Кроссинговер жиілігі локустар арақашықтығымен пропорционалды 
болуы  себепті,  рекомбинация  дэрежесін  хромосома  ұзындығының 
бірлігі ретінде қарастыруға болады. 
|
Гендік  картадағы  арақашықтықты  өлшеу  бірлігі  ретінде  санти- 
морган  бекітілген.  Сантиморган  классикалық  генетика термині  бо­
лып  табылады.  1  сМ,  шамамен  1  миллион  п.о.  сәйкес  келеді  жэне 
мейоздағы табиғи  рекомбинация үдерісі  кезіндегі  екі  локустың 
1

тец ажырау ықтималдығын білдіреді. Екі локус бір-бірінен неғұрлым 
қашық орналасқан, яғни  олардыц аралығындағы  сМ ұзындығы көп 
болған сайын, мейоздагы кроссинговер үдерісі кезіндегі олардыц бір- 
бірінен  ажырап  кету мүмкіндігі де  жоғары  келеді.  Сүтқоректілерде 
екі  кроссинговер  уақиғасы,  шамамен  20  сМ  болғандықтан,  осын- 
дай  өлшем  бірлікті  карта  ұзындығын  сипаттау  үшін  бір  маркер 
жеткілікп. Мысалы, ұзындығы 3000 сМ тең ірі қара геномын зерттеу 
үшін зерттеудің бастапқы кезеңінде  геном бойына біртегіс бөлінген
150 маркер жеткілікті болады. 
c v
Сонымен,  генетикалық  гендік  карталар  дегеніміз  геномдағы 
нэсілдік  мэліметтердің  жекелеген  телімдерін  бағдарлау  болып 
келеді.
Тіркесу  картасын  құрастыру  үшін,  негізінен  микросателлитті
92

маркерлер қолданылады, өйткені жоғары полиморфизм себепті олар 
тіркесу  картасының  мейлінше  толық  нүсқасын  жасауға  мүмкіндік 
береді.  Микросателлиттер  жақын  туысты  мал  түрлерін  салыстыр- 
малы  гендік  карталандыруда  қолдануға да  пайдалы  екен.  Мысалы, 
ірі  қарада  анықталған  микросателлитті  маркерлер,  доңыздарда  да 
қолданыла  алады  жэне  керісінше  де  болуы  мүмкін.  Осындай  жол­
мен  бір  жануарлардағы  ген  картасы  орналасуы,  екінші  түрге  жата­
тын жануарларда да болжанған болатын 
(Noore et ah,  1994).
Физикалъщ  гендік  карталар
  дегеніміз  -   белгілі  бір  хромосома- 
дағы  ген  не  болмаса  ДНҚ-ның  локализацияланған  орны  көрсетіл- 
ген карта.
Мұнда  геннің  орналасулық  координациясын  анықтау  үшін 
цитогенетикалык  кұрылымдар  пайдаланылады.  ДНҚ-ның  тізбегін 
карталау белгілі бір хромосомаға, хромосом теліміне, хромосомдық 
бендаға,  хромосом  бөлшектеріне  катысты  жүргізілуі  мүмкін. 
Физикалық  карталау  үшін  әртүрлі  әдістер  қолданылады: 
«in  situ» 
гибридизациясы,  денелік  жасуша  гибридтерінің  панелі  (SC-панелі) 
және радиациялық гибридтер панелі (RH-панелі).
«In situ»
 гибридизациясы белгілі бір ұлпада, жасуша мен хромо- 
сомада орналасқан генетикалық зондтың көзбен корінуіне мүмкіндік 
бергендіктен, ДНҚ тізбегі орналаскан телімді аныктауга жагдай жа- 
салады. 
«In  situ»
  гибридизациясының  түрі  ретінде,  зондта
флурох
пайдаланылатын,  флуоресцентті
аталатын эдісі қолданылады
Денелік  жасуига  гибридтерінің  панелі  (SC-панелі)
  көптеген 
жасуша  желісінде  бар,  алайда  қазіргі  кезде,  негізінен  қытай 
атжалманының  (СНО)  аналық  жұмытқасында  басқа түрге  жататын 
жануардың хромосомасының болуымен сипатталады. Бұл әдіс генді
белгілі бір хромосомга жеткізуге мүмкіндік береді.
RH-панелі
  иесінің  хромосомасынан  басқа  (мысалы  атжалман- 
ның), радиоактивті сэулелендіру арқьшы алынган зерттелетін түрдің 
хромосомасының  жекелеген  бөліктеріне  де  ие  болуы  мүмкін. 
RH- 
карталауы
  -   ДНҚ  тіркестерінің  арақашықтыгын  сантирадта 
(cR) 
жэне  оның хромосомадагы  орналасу  аймагын  анықтауга мүмкіндік 
беретін статистикалық эдіс. Қазіргі кезде RH-панелдері эртүрлі ауыл
шаруашылық малдарына алынған.
Салыстырмалы  гендік  карталар.
  Эволюциялық  тұрғыдан
93

барлық  тірі  ағзалар  бір-біріне  туыс  болып  келетіндіктен,  бір 
жануардың  геномының  құрылымын  білу  екінші  бір  жануардың 
геномы  жөнінде  пайдалы  мәліметтер  беруі  мүмкін.  Салыстырма- 
лы  гендік  карталар  — хромосомалар  эволюциялық  үдеріс  кезінде 
түрақты  сақталып  қалады,  сондықтан  екі  жэне  одан  да  көп  жануар 
түрлерінде гомологиялық гендер телімдерінің ұқсас тұрақтануы (ло- 
кализациясы) орын алады деген түжырымга сүйенеді.
Әртүрлі  жануарлардың  RH-панелін  жасап  шығару  салыс- 
тырмалы  карталауды  жүргізуге  мүмкіндік  туғызу  арқылы,  ақыр 
соңында  сүтқоректі  жануарлар  хромосомасының  эволюциясын 
түсінуге  мүмкіндік  береді.  Бір  жануар  түрінде  ашылган  гендер, 
гомологиялық  хромосомасы  белгілі  екінші  жануардагы  сондай 
гендердің ерекшеліктерін анықтауга жэрдемін тигізеді.
2.7 Гендік диагностика
1970  жылдардың  басында  Стэнфорд  университетінің  галым- 
дары Пол Берг, Герберт Бойер, Стэнли Коэнмен бірге алгаш рет генді 
клондау  жүмыстарын  жүргізу  арқылы  молекулалық  биологияның 
болашагының  зор  екендігін  көрсетті.  Берг  Е.соіі  хромосомасының 
ДНҚ  мен  SV40  (маймыл  вирусы  40)  деп  аталатын  приматтар 
вирусының ДНҚ-сын біріктірген кезден бастап рекомбинантты ДНҚ 
технологиясы  ашылды деп есептеуге  болады.  Берг алгаш рет E.coli 
хромосомасы  мен  SV40  ДНҚ-сын  бөліп  алды.  Осыдан  кейін  ол  екі 
үлгіні  EcoRI  ферментімен  өңдеді  жэне  оларды  ДНҚ лигазамен  бір 
пробиркага салды, нэтижесінде алгашқы гибридті молекула түзілді. 
Осы  зерттеулердің  маңыздылыгын  1980  жылы  Пол  Бергтің  химия 
саласындагы  Нобель  сыйлыгына  ие  болуы  дәлелдейді.  Ол  шыгу 
тегі  эртүрлі  ДНҚ  молекулаларын  бір  ферментпен  өңдеп,  алынган 
бөліктерді  біріктіріп,  рекомбинантгы  ДНҚ  молекуласын  алу 
мүмкін  екендігін  дэлелдеді.  Берг  бұл  сыйлықты  одан  бөлек  ДНҚ- 
ны секвенирлеуді ашқан Уолтер Гилберт жэне Фредерик Сэнгермен 
бөлісті. 
Щ
 
='  ЩЩ 
”•
Гендік  диагностика  (ДНҚ-диагностика)  геномдық  сараптау 
жүмыстары  қолданылуының  бір  түрі  болып  табылады.  Мүның 
міндеті  гендердің  полиморфты  нүсқаларын  анықтау.  Гендік  диа­
гностика  мал  шаруашылыгында  қолданылып  келінген  дәстүрлі
94

фенотиптік бағалау жұмыстарына қосымша қолданылатын жаңа эдіс 
түрі  болып  табылады.  Гендік  диагностикалау  тек  ДНҚ  сараптауға 
негізделетіндіктен, белгінің фенотиптік көрініс беруі үлкен маңызға 
ие  болмайды.  Гендік  диагностикалаудың  мал  шаруашылығында 
бұрыннан  қолданылып  келе  жатқан  дәстүрлі  бағалау  әдістерінен 
басты айьфмашылықтары да осында.
Гендік диагностикалау жұмыстарының жүргізілуіне негіз беретін 
басты  басымдық  —  барлык  тұқым  қуалай  берілетін  белгілердің 
негізінде  жататын  генетикалық  полиморфизм  кұбылысы  болып 
табылады.  Генетикалық  полиморфизм  дегенде  белгінің,  кем  де- 
генде  екі  көрінісіне  (аллелдер)  жауап  бере  алатын  нақты  локус  ай- 
тылады. Локустың полиморфты сипаты аллельдер санының көп бол- 
уьша  байланысты  артады.  Үш  жэне  одан  да  көп  аллельді  локустар 
ретінде сипатталатын белгілерге ауыл шаруашылық жануарларының 
қан  топтарын  жатқызуға  болады.  Сонымен  бірге  ДНҚ  мен  ақуыз 
полиморфизмдерінен  баска  хромосомдык  полиморфизмдерді  де 
ажыратады.
Генетикалық  полиморфизм  фенотиптік,  биохимиялық,  хромо­
сомдык, молекул ал ық жэне гендік деңгейлерде анықталуы мүмкін.
Молекулярлы-генетикалык полиморфизм жөніндегі эңгімелерде
ДНҚ құрылымындағы  эртүрлі  мутациялар әсерінен:  нүктелік мута- 
циялар,  бір  немесе  бірнеше  нуклеотидтерге  қатысты  делеция  мен 
инсерция  болатын  өзгерістер  жөнінде  айтылады.  Ең  көп  таралған 
полиморфизм типі нүктелік мутациялар әсерінен туындайды.
«Нүктелік  мутация»
  деп  ДНҚ  нуклеотидтік  тізбегіндегі  бір 
азоттық  негіздің  басқа  біреуімен  алмастырылуы  салдарынан  бола­
тын локальдық өзгеріс айтылады.
Соңғы  кездері  бірен-саран  нуклеотидтік  алмастырулар  туралы
кең  қолданысқа  енген  термин  ретінде  жалғызылікті 
нуклеотидтер
полиморфизмін  (SNPs)
 айтуға болады.
SNPs -
 популяцияда кездесетін әртүрлі нуклеотидтер (аллелдер) 
түріндегі  геномдық  ДНҚ  тізбегінің  позициясы  жэне  мұнда  сирек 
кездесетін  аллельдер  жиілігі  1%  төмен  болмауы  шарт.  Егер  сирек 
кездесетін аллельдер жиілігі 
20
% артық болса, онда 
«көп таралган
SNPs»
 делінеді.
Генетикалык  полиморфизм  құрылымдык  ақуыздармен  қатар, 
коделенбейтін  нуклеотидтік  тізбектерге  де  тэн  келеді.  Ақуыздарды 
коделейтін  құрылымдық  гендерге  қатысты  ДНҚ  құрылымындағы
95

өзгерістер,  ақуыз  құрамындағы  аминқышқылдары  тізбектсрінің 
орын алмасуларына, ал ол өз кезегінде геннің кызметінің бұзылуына
л
 
Я Ё
алып
реттік  қатарында  стоп-кодонның  пайда  болуына  жағдай  тудырып, 
ал ол өз кезегінде транскрипцияның токтатылуы  мен тиісті  қызметі
бұзылган ақуыздардың түзілуіне алып келеді.
Коделейтін  аймақтардағы  нүктелік  мутациялар  бір  аминкыш- 
қылының екіншісімен алмастырылуына алып келіп, соның себебінен 
аминқышқылының  құрылымы  жэне  ақуыз  қызмеп  де  өзгереді.
бұл  да  әртүрлі
генетикалық ауруларға алып келеді.
Нүктелік мутацияларды диагностикалау,
тізбектік
реакциясы,  яғни  ПТР  (немесе  орыс.  ПЦР-полимеразная  цепная  ре­
акция)  жэне  рестрикциялық  бөліктердің  ұзындығы  полиморфизмі, 
яғни РБҰП (немесе орыс. ПДРФ -  полиморфизм длин рестрикцион­
ных фрагментов) сараптаулары.
6-кесте
Белгіленуі
Нүктелік мутацияларды детекциялау әдістері
Қысқаша сипаттамасы
РБҰП
(RFLP)
ПТР - РБҰП 
(PCR RFLP)
АС- ПТР 
(AS-PCR)
Геномдық ДНҚ-ын тиісті рестрикциялық ферменттер 
арқылы ыдырату жэне одан ары гельде бөлу мен
Southern бойьпппа гибридтеу
мутациясы
амплификациялау жэне оны одан ары карай ПДРФ
арқылы сараптау
___ _____ — —


— —
— —
Әр аллельдің арнайы праймерлері көмегімен нүктелік
мутациясы бар бәлшегін амплификациялау
ЛЦР (LCR)
Термостабильді ДНҚ-лигазаны пайдалана 
отырып, матрицаға комплементарлы LCR жэие 
аллелеспецификалық праймерлерді SNP тән лигирлеу
Гетеродуплекс
сараптаулары
Одан ары қарай ренатурацияға ұлгасатын ПЦР өнімінің 
бастапқы денатурациясы және гельэлектрофорез эдісі 
______арқылы қозгалгыштыгын анықтау________
Секвенирлеу
нуклеотидпк
тіркесін аныктау
96

6-кестенің жалгасы
SSCP
Денатурлемейтін гельде құрамында нүктелік мутациясы 
бар бір үзікті (одноцепочных) ДНҚ бөлшегінің
нуклеотидтік тізбегін анықгау
Масс-
спектрометрия
Матрицадағы ДНҚ молекуласының ионизациясы 
жэне электр өрісіндегі оның қуалануы мен қозғалу
жылдамдығының анықталуы.
2 .
7.
1 ПТР (ПЦР) — cap an may
Полимеразды тізбектік реакция (ПТР) әдісінің ұстанымын алғаш 
рет  1983  жылы  Кэрри  Мюллис  ұсынған  болатын.  ПТР-ның  ашы- 
луы  молекулалық  биология  саласының  соңғы  30  жыл  бойындағы 
ең керемет жаңалықтарының бірі  болды.  Осы жаңалығы үшін  Кэр­
ри  Мюллиске  1993  жылы  химия  саласындағы  Нобель  сыйлығы 
берілді. ПТР әдісінің пайда болуына молекулалық генетикадағы қол 
жеткен  табыстар,  ең  алдымен  бірталай  микроағзалар  геномының 
нуклеотидті  тізбектерінің  аныкталуы  тікелей  жэрдем  берді.  Соны- 
мен  қатар  ПТР  әдісінің  пайда болуына ыстық гейзерлерде тіршілік 
ететін  бактерияларда  (
Thermis  aquaticus
)  кездесетін  taq-ДНК- 
полимераза ферментінің ашылуы көп эсер етті.  Бұл бактерияның ең 
басты  артықшылығы  -   температураға  айрықша  төзімділігі  (+95°С 
температурада 45 минут бойына жартылай тірі күйінде сақтала ала- 
ды) жэне жоғары температурада -  оптимум 72°С жұмыс істеуінде.
Қазіргі  кезде  ПТР-сараптамасы  арқылы  эртүрлі  ауруларды 
жэне  оның  ішінде  киын  культивирленетін  агенттер  тарапынан  ту- 
ындайтын  ауруларды,  микроағзалардьщ  генотиптерін  аныктау, 
олардың  вируленттілігін  бағалау,  микроағзалардың  антибиотик- 
терге  төзімділігін  анықгау,  пренетальды  диагностика,  қаннан  да- 
йындалатын  дәрмектерді  биологиялық  қадағалау  сияқты  көптеген 
жұмыстарда кеңінен колданады.
ПТР-сараптамасы
  дегеніміз  І   ДНҚ-ның  белгілі  бір  телімін 
бөліп алып, бірнеше сағат ішінде in vitro жагдайында миллиардтаған 
есе  (108-109)  көбейтуте  мүмкіндік  беретін  ДНҚ  амплификациясы 
эдісі.  Осындай  жолмен  бір  геном  телімінің  көптеген  көшірмесін 
алу  мүмкіндігі,  қолдағы  ДНҚ  сынамасын  зерттеуді  анағұрлым 
жеңілдетеді.
ПТР  эдісінің  негізінде  табиғи  үдеріс,  яғни  ДНК-полимераза 
7-11
34 
97

ферменті  көмегі  арқылы  ДНҚ  матрицасының  комплиментарны 
қалануы  (достраивание)  жатады.  Бұл  реакция  ДНҚ  репликациясы
деген атқа ие.
ДНҚ-ның  табиғи  репликациясы  бірнеше  саты  арқылы  жүзеге 
асырылады:
1.  ДНҚ  денатурациясы  (қос  спиральдің  жазылып,  ДНҚ  жіп-
терінің ажырауы);
2.  ДНҚ-ның қысқа екі үзікгі (двухцепочных) телімдерінің пай-
да болуы (ДНҚ синтезінің басталуы үшін қажетті бастама);
3.  ДНҚ-ныц жаңа үзіктерінің (цепи) синтезі.
Жұмыс  істеуінің  оптималды  температурасы  70-72  С  тең
термофильді 
Thermis 
aquaticus
 
бактерияларынан 
алынатын 
термотұрақты  ДНК-полимеразасының  (Taq-полимеразасы)  ашы- 
луы,  ДНҚ  репликациясы  үдерісінің  кезеңділігін  (циклдылығын) 
және  оның 
in  vitro
  жағдайында  жүмыс  істеуін  қамтамасыз  етті. 
Белгіленген  режим  бойынша,  температураның  кезецдік  алмасула- 
рын  қамтамасыз  ете  алатын  бағдарламалы  термостаттардың  (ам- 
плификаторлар)  жасалуы,  ПТР  әдісінің  зертханалық  клиникалық 
диагностикалау  жүмыстарында  кеңінен  колданылуына  жағдай  жа- 
сады. Синтездеу кезеццерін көп рет қайталау нәтижесінде ДНҚ-ның 
спецификалық  телімі  көшірмесінің  экспоненциалды  көбеюі  орын 
алып,  бүл  өз  кезегінде  жекелеген  жасушадан  алынатын  сараптау 
материалынан  жеткілікті  мөлшерде  ДНҚ  көшірмесінің  алынуына 
жэне оны  одан  ары  карай  электрофорез  әдісі  арқылы түстеп-тануға
мүмкіндік береді.
Үзіктердің  (цеп)  комплементарлы  жалғасуы  ДНҚ тіркесінің  кез
келген  жерінде  емес, тек белгілі  бір  старттық блоктарында — қысқа
екіжіпті телімінде басталады. Осындай блоктарды ДНҚ-ның арнайы
(спецификалық) телімдеріне косқан жағдайда,  жаңа үзіктер  синтезі
үдерісінің ДНК-ның бүкіл үзына бойына емес, тек қана  осы телімде
жүруін қамтамасыз етуге болады.
ДНҚ-ның қажетті телімінде старттық блоктардың жасалуы үшін 
праймер  деп  аталатын  екі  олигонуклеотидті  бастамалар  (затравки) 
қолданылады (20-30 нуклеотидті жүп). Праймерлер ДНҚ бөлшегінің 
оң  жэне  сол  жақ  шекара  шебіндегі  тізбектеріне  комплементарлы 
жэне ДНҚ-ның  жаңа үзігініц тіркесуі тек  қана осы  екі  аралығында 
жүзеге  асырылуына бағытталады.  ДНҚ телімінің  бастапқы  қажетті 
нұсқасының жеткілікті  мөлшердегі көшірмесін  алу үшін,  амплифи- 
кациялау жүмысы бірнеше (20-40) кезенде (цикл) жүргізіледі.
98

Амплификация жүргізу үшін келесі компоненттер қажет болады:
•  ДНҚ-матрица (ДНҚ не болмаса оның нақты бөлшегі);
•  Праймерлері  (арнайы  бөлшектегі  шекара  аймағында  ДНҚ 
тізбегіне  комплементарлы  келетін  20-30  нуклеотидті  жұптан  тұра- 
тын синтетикалық олигонкулеотидтер). Амплификацияның бағытты 
жүргізіліп жұмыстың сапалы өтуіне ДНҚ-ның лайықты бөлшегі мен 
праймердің таңдап алынуы зор маңызға ие;
•  Дезоксинуклеотидтрифосфаттар  қоспасы  (дНТФ)  (ДНҚ-ның 
жаңа  комплементарлы  үзігі  (цеп)  үшін  қажетті  материал  болып  та- 
былатын төрт дНТФ қоспасы);
•  Тац-полимераза  ферменті  (синтезделіп  жатқан  ДНҚ-на  жал-
ғастырылатын  нуклеотидтік  тізоектерінің  ұзаруын  катализдеитін 
термотұрақты ДНК-полимераза);
• 
Буферлі  ерітінді  (фермент  белсенділігін  қолдауға  лайықты 
қүрамында Mg2+ ионы бар реакциялық орта).
дНТФ
ДНК-матрица
I
фермент
Тад-полимераза
lil I llil'l I hi IM111 lil'l I I'l I
П м і м
олигонуклеотидтер
праймерлер
ПТР-дің бастапқы компоненттері
22-сурет.  ПТР эдісінің жүзеге асырылуына қажетті заттар
Амплификацияның  эрбір  өтілуі  түрлі  температуралық  режимді 
талап ететін 3  кезеңнен тұрады:
1-кезең:  ДНҚ  денатурациясы  (қос  спиральдің  жазылуы).  Бұл 
кезеңге қажетті температура 93-95  градус, өтілу мерзімі  30-40 сек.
2-кезең: Праймерлерің косылуы (күйдіру, отжиг). Праймерлердің 
қосылуы арнайы  бөлшектегі  шекара аймағында ДНҚ тізбегіне ком­
плементарлы телімінде жүзеге асырылады. Әрбір праймерлер жүбы 
үшін 50-65 градус аралығындағы лайықты күйдіру температуралары 
болады.  Күйдіру үзактыгы 20-60 сек.
3-кезең. ДНҚ-үзіктерінің (цепи) құрастырылуы. ДНҚ үзіктерінің 
комплементарлы  кұрастырылуы,  праймер  телімдерін  қосудан  бас-
99

талып,  5-ұшынан  3-ұшына  қарай  қарама-қарсы  бағыттарда  жүзеге 
асырылады.  ДНҚ-ның  жаңа  үзіктерінің  синтезіне  кажетті  мате­
риал  ретінде  ерітінді  құрамына  қосылатын  дезоксирибонуклео- 
тидтрифосфаттар  (дНТФ)  болады.  Синтез  үдерісі  термотүрақты 
бактериялардың ДНК-полимераза  ферменті  (Тац-полимераза)  тара-
пынан  катализденеді  жэне  70-72  градус  температурада  20-40  сек,
уақытқа созылады.
1 -кезең
Амплификацияның бірінші кезеңі
и 11 МП I и I Һі 111 hi'i i 
hi
 I
Денатурация 
93-95°C
ДНҚ-ның бастапқы бөлшегі
2-кезең 
Праймерлерді 
қыздыру 
50-65°С
3'«
іІЧ І 
и
■ э
3-кезең
ДНК
• 

үзіктеріні
синтезі
72°С
П I  hi  I  III  1 1 1ІІІЧI
23-сурет. Амплификацияның  1 -кезеңі
кезеңде  түзілген  ДНҚ-ның  жаңа  үзіктері  ДНҚ-ның  ар- 
!гі (ампликон) пайда болатын екінші кезеңге қажетгі ма- 
етін  атқарады.  Кейінгі  өтетін  ампликация  кезендерінде 
р жаңа үзіктер синтезі үшін матрица бола алады. 
я  жолмен  ерітіндегі  ампликондар  мөлшері  2п  формула- 
^•ы  (п-  амплификация  кезендерінің  саны)  артады.  Сол
100

себепті,  егер  бастапқы  ерітіндіде  ДНҚ-ның  екі  үзікті  жалғыз  моле- 
куласы  ғана  болса  да,  30-40  кезендерден  кейін  ерітінді  құрамында 
ампликонның  108  молекуласындай  жинақтала  алады.  Сонымен 
осындай  эдіс  арқылы  алынған  материалдар  электрофорез  арқылы 
қажетті  ДНҚ  бөлшегінің  визуалды  детекциясын  жүргізіп  нақты 
анықтаута жеткілікті болады.
Амплификацияның 2-көзеңі
Id 11ҺІЧI lil I И11 llil’l III
1 -кезең 
Денатурация 
Ш
11
 һіч I hi I iii 
111
 hi1! I m i

n
 I 
n
 О К І І RfRlfKSI 01?PT
2-кезең
Праймер қыздыру
3-кезең
ДНК үзіктерінің синтезі
hi 11 lil'l I lil I lil 111 lil1! I
I I lil1! I Ы I lil I I I lil1! I
А м п л и ф и к а ц и я  
ө н і м д е р і
і
ІІ11 lil1! I kl I lil 111 hl'l I
11 lil'l I hi I lil I II hl'l iffi
24-сурет. Амплификацияның 2-кезеңі
2.7.2 РБ¥П  (ПДРФ) -  саршгтауы
XX  ғасырдың  70-жылдарының  басында  генді  клондау  мүмкін 
болды.  Шамамен,  бір  уақытта  ашылған  көптеген  жаңалыктар  мен 
бірнеше  ғалымдардың  ынтымақтаса  жұмыс  істеуі  нэтижесінде 
гендерді клондау мен рекомбинантты ДНҚ технологиясының жүзеге 
асырылуын мүмкін ететін негізгі екі компоненттің -  рестрикциялық 
ферменттер  мен  плазмидалардың  (плазмидті  ДНҚ)  анықталуына 
жағдай  жасалды.  Рестрикциялық  ферменттер  ДНҚ-ны  кесуші  фер-
101

менттер,  ал  плазмидалық  ДНҚ  сақиналы,  өздігінен  репликацияла- 
натын түрі жэне зерттеушілер оны ДНҚ-ның басқа бөліктерін тасы­
малдау мен клондау үшін манипуляциялайды.
Микробиологтар  1960  жылдары  бактериофагтың  зақымына 
төзімді  бактерияларды  тапты  жэне  олар  фаг  репликациясын  “шек- 
тей”  алатын  бактериялар  екендігі  анықталды.  Швейцария  ғалымы 
Вернер  Арбер  фагтардың  шектеулі  өсуі  кейбір  бактериялар  өзінің 
ферменттері  көмегімен фаг ДНҚ-сын кіші бөліктерге  кесіп,  фаг ре­
пликациясын  тоқтата  алатындықтан  деген  болжамды  ұсынды.  Осы 
қасиетіне байланысты мұндай ферменттер—рестрикция ферменттері
деп аталатын болды.
1970  жылы 
Haemophilus  influenzae
 бактериясымен  жүмыс  істе-
ген  Джон  Хопкинс  университетініц  ғалымы  Гамильтон  Смит  ДНҚ 
клондауда  қолданылатын  алғашқы  Hind-III  ферментін  бөліп  алды. 
Рестрикция  ферменттері  қосымша  рестрикция  эндонуклеазалары 
(эндо, «ішкі»; нуклеаза «нуклеин кышқылын кесетін фермент») деп 
аталады,  себебі  олар  ДНҚ  «өз  ішінде»  кесе  алады.  ДНҚ  шеттерін 
кесетін  ферменттер экзонуклеазалар деп аталады.  Смит ДНҚ Hind- 
III ферментініц көмегімен кіші фрагменттерге кесіле немесе ыдыра- 
тыла алатынын көрсетті.  1978 жылы Гамильтон Смит, Вернер Арбер 
мен Даниель Натане Нобель сыйлығын бірге алды.
Рестрикциялық  ферменттерді  зерттеушілер  ДНҚ-мен  жасайтын 
манипуляция кезінде қолданатын «қайшы» деп атайды.  Г.  Смит пен 
басқалар  рестрикциялық  ферменттерді  қолдана  бастағаннан  бері 
соцғы  30  жылда  осы  ферменттер  көмегімен  жұмыс  істеу  эдістері 
жетілдірілді.  Қазіргі  кезде  300-ден  астам  фермент  коммерциялық 
тұрғыдан нарыққа шығарылған жэне бағасы аса қымбат та емес.
Рестрикциялық 
ферменттер 
алдымен 
бактерияларда 
та- 
былды  және  оларға  бактериялардың  туысы  мен  түріне  байла­
нысты  қысқартылған  аттар  берілді.  Мысалы,  EcoRI,  алғашқы 
бөлініп  алынған  рестрикциялық  ферменттерінің  бірі,  ол  Е.соіі 
бактериясының RYI3 штамында анықталды.
Рестрикциялық 
ферменттер 
ДНҚ-ныц 
тізбегінде 
жақын 
орналасқан  нуклеотидтердің  фосфодиэфирлік  байланысын  үзеді. 
Бірақ рестрикциялық ферменттер ДНҚ-ны кездейсоқ кеспейді жэне 
барлық ферменттер ДНҚ-ын бірдей жерден кеспейді. Басқа фермент­
тер  сияқты,  рестрикциялық  ферменттер  белгілі  бір  субстраттарға 
спецификалық  қасиет  көрсетеді.  Осы  ферменттер  үшін  ДНҚ  суб-
102

страт  болады.  Рестрикциялық ферменттер  рестрикциялық сайт деп 
аталатын ДНҚ-ның спецификалық азоттық негіздер тізбегін тану мен 
кесу (ыдырату) үшін субстратпен байланысады. Неге рестрикциялық 
ферменттер бактерия  жасушасының ішінде ДНҚ-ны  кеспейді?  Бак- 
териялар өз ДНҚ-сының кейбір нуклеотидтерін метилдеу көмегімен 
рестрикциялык ферментгерден қорғайтыны белгілі болды.
Рестрикциялық  бөліктердің  ұзындығы  полиморфизмі,  не­
месе  РБҰП-сараптаулары  гендердің  түрлі  нұсқаларын  анықтау 
жұмыстарында кең қолданысқа ие болды.
Рестрикциялык,  бөліктердің  үзындыгы  полиморфизмі  (РБҮП) 
сараптаулары  (Restriction  fragment  length  polymorphism,  RFLP) 
дегеніміз ДНҚ-ын рестрикциялык эндонуклеаз ферменттері аркылы 
кесіп,  пайда  болған  кесінді  бөлшектерін  гельді  элекрофорез  (ДНҚ 
электрофорез)  эдісін  қолдана  отырып  сараптап,  геномдык ДНҚ-ын
зерттеуге арналған арнайы эдіс.
РБ¥П
  эртүрлілігін  сараптау  геномның  картасын  жасауда, 
тұқым  қуалай  берілетін  гендердің локализациясын  анықтауда,  ауру 
каупінің дэрежесін білуде, генетикалык таңбаларды (ізтаңба) түстеп 
тани  отырып  туыстық  деңгейді  аныктау  жұмыстарында  кеңінен
қолданылады.
Б¥П-сараптауларын 
жүргізу 
үшін 
ДНҚ-ын 
байланы- 
су  телімдерінен  кесе  алатын  арнайы  ферменттер,  яғни  ІІ-типті 
рестрикциялык  эндонуклеазалар  қажет.  Қазіргі  кезде  200-ден  аса 
бактериялар  штамдарынан  алынатын  400-ге  тарта  осындай  фер­
менттер,  ДНҚ-ның  90  телімі  аумағын  кесе  алатындығы  ғылымға
белгілі болды.
Қазір  тетра-,  пента-  жэне  гексануклеазалардың  тиісінше  төрт, 
бес  және  алты  нуклеотидтерді  тани  алатындығы  анықталған. 
Тертрануклеазаның мысалы  ретінде 
Haemophilus aegyptius
  бөлініп 
алынған 5 ’ -  ГГ7ЦЦ-3 ’  тани алатын 
Нае III
 ферментін айтуға бола­
ды. Гексануклеаза ретінде 
Е.СоІі
 боліп алынған жэне 5’ -  ГГА/ЦЦЦ- 
3 ’  тани алатын 
EcoRI
  ферментін айта аламыз.
Егер ДНҚ-ның сарапталатын телімінде рестрикциялык фермент 
танитын  тізбектері  болмаса,  онда  бір  бөлшегінің  үзындығының 
артык  болатьшы  байқалады.  Телімді  кесетін  рестрикциялык 
ферменті болған жагдайда, кысқа бөлшектердіц пайда болуы жүзеге
асырылады.
РБ¥П  көбінесе  ыдырау  теліміндегі  мутациялар  нэтижесінде 
шакырылады,  алайда  баска  да  себептері  болуы  мүмкін  -   рестрик-
103

ция  сайты  арасына  мобильді  элементтердің  кіруі  не  болмаса 
микросаттелиттің  ұзаруы  есептерінен.  Нуклеотидтік  алмасулар 
ДНҚ-ның  коделенбейтін  телімдерінде  де  жиі  кездеседі.  Осындай 
алмасулардың  бірталайы  рестрикция  көрінісінің  өзгеруіне  алып 
келеді. Зерттелетін геннің қасында не болмаса ішінде орналасқан по- 
лиморфты сайт осы геннің аллельді түрлеріне маркер (белгі) ретінде
бола алады.
Рестрикциялық  бөліктердің  ұзындығы  полиморфизмі  (РБ¥П) 
сараптаулары  келесі  кезендік:  геномдық  ДНҚ  бөліп  алу,  арнайы 
эндонуклеаза  арқылы  оны  рестрикациялау,  пайда  болған  ДНҚ 
бөліктерін  электрофоретикалық  ажырату  (болу)  жэне  құрамында 
полиморфты сайт рестрикциясы бар оны (ДНҚ бөліктерін) Саузерн 
блот-гибридизация  эдісі  арқылы  идентификациялау  жұмыстары
нэтижесінде атқарылады.
Саузерн  блот  сараптауы  (Саузерн  блотгингі  немесе  гибриди- 
зациясы)  деп  аталатын  эдіс  ген  көшірмелерінің  санын  анықтауда 
жиі  қолданылады.  1975  жылы  Эд  Саузернмен  жетілдірілген  Сау­
зерн  блоттингі  ДНҚ-ның  рестриктазалармен  кіші  фрагменттерге
кесілуінен басталады.
Саузерн  бойынша  гибридизациялауда  электрофоретикалық 
ажырату  (бөлу)  жұмысынан  кейін  ДНҚ-ның  рестрикцияланған 
бөліктерінің  көлемдері  мен  өзара  орналасуларын  анықтауға 
мүмкіндік береді.  Рестрикция сайтындағы мутациялық өзгерістерді 
арнайы 
ДНҚ-зондыларымен 
будандасқан 
(гибридацияланған) 
ДНҚ-ның  рестрикциялык  бөліктерінің  ұзындықтарының  өзгеруін 
бақылау  арқылы  оңай  байқауға  болады.  Рестрикация  сайтының 
бірінде  жүрген  мутация  нәтижесінде  рестрикция  соңында  бұл 
сайттың ыдырамай қалуы орын алып,  мутантты сайттармен бөлініп 
тұрған  ДНҚ-ның  қатарлас  орналасқан  бөліктерінің  қосылысуына 
алып  келеді  жэне  соның  нәтижесінде  ДНҚ-ныц  үлкен  бөлшегініц 
пайда  болуына  жол  беріледі.  Сондықтан,  полиморфты  сайттағы 
рестрикцияның  жүрмеуі  себепті  электрофореграммада  не  болмаса 
радиограммадағы суретте (ДНҚ-зондтарды белгілеу (мечения) түріне 
байланысты), сол  эндонуклеазаға лайықты  қатарлас  орналасқан ре­
стрикция  сайтгарының ДНҚ ұзындығына  сәйкес  бір  үлкен  бөлшек 
анық  байқалады.  Ал  полиморфты  локустағы  рестрикцияныц 
жүруі  нәтижесінде,  аумағы  полиморфты  рестрикция  сайты  мен 
жақын  маңдағы  тұракты  рестрикция  сайты  арақашықтығына  сай 
келетін  кіші  көлемді  бөлшек  электрофореграмма  суретінде  көрініс
104

береді.  Нәтижесінде  құрамына  мутантты  сайтар  кіретін  ДНҚ-ның 
рестрикциялық бөліктері  полиморфты  келеді  жэне  бұл  ерекшелікті 
эртүрлі  ағза  ДНҚ-ын  салыстыруда  РБ¥П  эдісі  аркылы  оңай
аныктауға мүмкіндік береді.
Белгілі  бір  гендермен  тіркескен  рестрикциялык  полиморфты 
сайттардың  бастапқы  идентификациясын,  оларға  лайыкты  зонд- 
тары  бар  болған  кездері  ғана  жүргізе  аламыз.  Одан  арғы  жұмыс 
полиморфизмді  анықтауға  арналған  рестрикциялық  нуклеазаны 
іздеп  табудан  тұрады.  Осы  мақсатта,  яғни  геномды  ДНҚ-ын  рес- 
трикциялау  үшін  туыс  емес  жануарлардан  бөліп  алынған  көптеген 
эндонуклеаз  ішінен  репрезантивті  тандап  алуға  мүмкіндігі  туылуы 
себепті, лайықгы эндонуклеаза іріктеп алынады. Кейіннен колда бар 
ДНҚ-зондтарын пайдалана отырып, әрбір рестриктаза үшін жекеле- 
ген РБ¥П сараптаулары жүргізіледі.  Бір популяцияда полиморфизм 
анықталған  соң,  дэл  сондай  жолмен  басқа  популяцияларда  зерттеу 
жүмыстары жүргізіледі.
РБ¥П  әдісі  популяцияларда  жүргізілетін  генетикалық  зерт- 
теулерде  жиі  қолданьшады,  ойткені  жануарлар  геномдарында 
ДНҚ-ның  белгілі  бір  рестрикциялық  бөлшегінің  болуы  оларды 
жақсы  генетикалық  маркер  ретінде  жэне  генотиппен  байланысқан 
фенотиптік белгі ретінде пайдалануға мүмкіндік береді. Осы арқылы 
популяция  қүрылымындағы  мүндай  маркерлердің  арақатынасын, 
будандастьфу  барысында  ата-енелерінен  ұрпақтарына  берілу 
ерекшеліктерін анықтауда жэне зерттелетін ағзалардың генетикалық 
карталарын  құруда  пайдалануға  мүмкіндік  береді.  Белгілі  бір 
генетикалық  локустарға  тиесілі  болуы  себепті  РБ¥П-маркерлерін 
пайдалану  мэліметпен  қамтамасыз  ету  түрғысынан  көп  таралған 
биохимиялық маркерлерден кем түспейді жэне копшілік жағдайларда 
көптеген  гендік  локустарға  байланысты  күрделі  фенотиптік 
белгілерді  (коздің,  шаштың,  жүннің  түстері  жэне  т.б.)  бағалауда 
ыңғайлы болып келеді.

1   2   3   4   5   6   7   8   9


©emirb.org 2017
әкімшілігінің қараңыз

войти | регистрация
    Басты бет


загрузить материал