Білім және ғылым министрлігі



жүктеу 1.01 Mb.

бет5/9
Дата22.04.2017
өлшемі1.01 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9

микрошшетка
•   •
11-сурет. 
Микроиньекция арқылы жасушаға ДНҚ ендіру
51

Операцияның  дэл  жүргізілуін  пронуклеустың  ісінуі  арқылы 
байқайды.  Тек  осылай  ядроның  ісінуін  сырттай  бақылай  отырып, 
ерітіндінің  пронуклеуске  ендірілгені  жөнінде  тоқтамға  келуге  бо­
лады.  Иньекцияланған эмбриондар тұтқыш пипеткадан босатылып, 
реципиентке отырғызылғанға дейін арнайы ортада өсіріледі.
Тышқан  мен  қоянның  ұрықтанған  аналық  жұмыртқаларында 
даму  кезеңінің  алынған  сатысына  лайықты  пронуклестері  анық
көрінеді жэне оңай иньекцияланады.
Ауыл  шаруашылық  жануарларының  цитоплазмасы  кұрамына
күңгірт  түсті  липидті  түйіршіктер  кіретін  болғандықтан,  про- 
нуклеустерді  көзбен  бақылау  жұмысын  қиындатады.  Сондықган
нэтижесінде,  түйіршіктер  аналық  жүмыртқасының  оір  жағына 
жинақталса,  ортаға  жақын  орналасатын  пронуклеустері  жақсы  кө- 
ріне бастайды жэне микроиньекциялау үшін ыңғайлы күйге ауысады. 
Қой  эмбриондары  үшін  әдетте  центрифугалаудың  қажеттілігі  жоқ: 
бұларда пронуклеусты бақылау үшін Номарский үлғайтқышын (оп- 
тикасын) пайдалану жеткілікті.  Осындай өндеулер жүргізілгенімен, 
ауыл  шаруашылық  жануарларының  эмбриондарын  микроиньек­
циялау  күрделі  болатындықтан,  тышқан  мен  қояндардағы  сияқгы
сенімді түрде жэне жылдам орындала қоймайды.
In vitro
 жағдайында аз уақыт (бірнеше сағатқа дейін) ұстағаннан 
кейін, 
эмбриондар 
күйіттері 
үйлестірілген 
реципиенттердің 
жүмыртқа  түтігіне  қондырылады.  Бүган  балама  (альтернатива) 
ретінде,  микроиньекцияланған  эмбриондарды  ұзағырақ  ұстау  мен 
күйіттері  үйлестірілген  реципиенттердің  жатырына  отырғызуды 
жүргізуге болады. Микроиньекция жүмысын жүргізу сызбанұсқасы
келесі 
12-суретте
 беріледі.
Гендер  (эмбриондар)  тасымалының  нәтижелі  өтуі  үшін 
отырғызылған  эмбрионның  ары  қарай  дамуы  физиологиялық 
жағынан  қамтамасыз  етілуі  қажет  болады.  Сондықтан  эмбриондар 
алынатын  донорлар  жэне  реципиенттердің  аналық  безі,  жүмыртқа 
түтігі мен жатыры қажетті жағдайда болуы үшін  күйіт үйлестірілуі 
міндетті  түрде  жүргізіледі.  Мүндай  күйіт  үйлестірулері  вазэкто- 
мирленген  (піштірілген,  яғни  стерильді)  аталықтарды  пайдалану, 
овуляцияны  адамның  хориондық  гормонын  (ХГ)  егу,  «жұмсақ»  су- 
перовуляциялау  не  болмаса сары денешіктің лютеолизі  арқылы жа- 
салынады.
52

Сиыр  мен  жылқыдан  басқа  ауыл  шаруашылық  жануарларында 
жұмыртқа  түтігіне  қан  шығармай  жету  мүмкін  болмайтындықтан, 
микроиньекцияланған  аналық  жұмыртқалары  реципиент  ағзасына 
хирургиялық  жолмен  тасымалданады.  Осы  мақсатта  жарамсыз 
(күйіті  үйлестірілмеген)  реципиенттерді  топтан  шығарып,  күйіті 
келген жануарларды анықтау үшін наркоз салынған реципиенттердің 
қарны  жарылып,  аналықтың  жұмыртқа  безіндегі  полиовуляцияны 
қоздыру нәтижесі анықталады (овуляцияланған жасушалардың, сары 
денешіктердің  болуы).  Содан  кейін  микроиньекцияланған  эмбрион 
сорылып  алынған арнайы  катетер жұмыртқа түтігіне ендіріліп,  осы 
жерге құрамында эмбрионы бар орта құйылады.
Суперовуляцияланған 
донорлар
Ген құрамасы тіркестірілген
плазмида
Зиготаны шаю
400х дейін үлкейту
▼   Аталық пронуклеусына 
микроинъекциялау
Эмбрионды тасымалдау
¥лла сынамасын
алу
Күйггі үйлестірілген 
рецепиенттер
Микроинъекцияланған 
эмбрионнан алынған 
урпақтар
ПТР сараптама
к
Т р а н сге н д і ж а н у а р л а р
12-сурет. 
Микроиньекция әдісінің жүргізілу нұсқасы
53

Тышқан,  коян  мен  шошканың  эрбір  реципиентіне  20-30
иньекцияланған  зиготалар  отырғызылады  және  мегежіндерге  бар-
лык эмбриондар жұмыртка түтігінің бір жағына ғана, ал тышқан мен 
кояндарда -  екі жак түтіктеріне де тасымалданады.  Қой,  ешкі жэне 
сиырларда эрбір реципиентке екі-төрт эмбрионннан отыргызылады.
Иньекцияланған  эмбриондардан  туылған  ұрпақтардың  эрқай- 
сысына белгі салынып, ДНҚ-ның нәтижелі сіңісіп кеткенін анықтау 
максатында  олардың  ұлпалары  мен  қандарынан  сынамалар  алына- 
ды.  ДНҚ-ның  интеграцияланғанын  PCR-диагностикалау,  Саузерн
бойынша дог, блотгибридтеу эдістері арқылы анықтайды.
Қалыпты  жағдайда  трансгеннің  тұқым  қуалауы  Г.  Мендельдің 
моногибридті заңцылыгына сэйкес келеді, өйткені көбінесе интегра- 
циялану бір хромосомның жекелеген нүктесінде ғана жүреді.  Соған 
байланысты  «гетерозигота»  термині  бұл  жерде  қолданылмайды, 
себебі  осындай  гомологиялық  хромосомда  трансгенге  лайықты 
аллель  болмайды.  Мозаикалы  жануарларға  келетін  болсақ,  олар 
әдетте  Ғ  генерацияларында  ғана  көрініс  береді.  Ғ,  генерациясы 
мен кейінгі ұрпактары (егерде олар позитивті болса) барлық денелік 
және  эмбриональдық жасушаларда  құрама гендерге  ие  бола  алады. 
Алайда бірнеше мысалда трансгендердің бір ұрпақтан кейін тұракты
берілмеу жағдайлары да байқалған. 
j
Бастапқы  трансгенді  жануарлар  геномында  интеграциялану
нүктесінің бірнешеу болу жағдайы өте сирек кездеседі.  Екі үлескіге 
интеграцияланған  трансгенді  малдардың үрпақтарында  75%  транс­
ген  түқым  қуалайды  (осы  кездері  ұрпақгың  25%  екі  трангеннің 
біреуі жэне 25% трангеннің екі нүктесі де беріледі) жэне тек 25% төл 
трансгенді  болып  шықпайды.  Гомозиготалы трансгенді үрпақтарды 
шагылыстыру  кезінде  қалыпты  жағдайда  келесідей  түқым  қуалау 
жүреді:  50% гомозиготалы, 25% гомозиготалы трансгенді жэне 25%
негаггивті (трансгенді емес). 

1997  жылдарға  дейін  генді  шарана  (зигота)  пронуклеусіне  ми- 
крои ньекциялау,  ірі  жануарлар  ішінде  трансгенді  хайуандар  алуда 
қолданылатын  жалғыз  эдіс  болып  келді.  Оны  алғаш  рет трансгенді 
тышқандар  алуда  (Gordon  J.  жэне  т.б.,  1985)  пайдаланса,  кейінірек 
(Hammer  R.  Е.  жэне  т.б.,  1985)  ауыл  шаруашылық  жануарларын 
алуда  да  қолдана  бастады.  Экономикалық  жагынан  қымбат  және 
техникалық тұрғыдан  күрделі  болуы  себепті,  бастапқы  кездері  бүл 
әдісті  ірі  ауыл  шаруашылық  малдарына,  атап  айтқанда  ірі  қараға
54

қолдану әлемдегі бірнеше зертханаларда ғана мүмкін еді. Ірі қараның 
in vitro жағдайында ұрықтандырылған эмбрионына гендерді микро- 
иньекциялау  эдісінің  ашылуы,  бұрынғы  қолданылып  келген  эм- 
бриондарды пронуклеус сатысында хирургиялық жолмен оталап, не 
болмаса суперовуляцияланған сиырды сойып барып алатын қымбат 
та машақатты  жұмысты  алмастыруға мүмкіндік берді  (Krimpenftort
Р. және басқалары.,  1991).
In  vitro  жағдайында  ұрықтандыру  арқылы  эмбриондар  алудың 
жаңа  мүмкіндігінің  ашылуы,  тұрақты  түрде  донор-сиырларды 
ұстауға  каражаты  жоқ  көптеген  кіші  зертханаларға  гендер  микрои- 
ньекция әдісін қолдануға жағдай тудырды. Алайда әдістің тиімділігі 
элі  де  томен  еді.  Өйткені  трансгені  геномға  ендірілген  жэне  өзі 
де  трансгенді  ұрпақ  бере  алатын  бір  трансгенді  мал  алу  үшін 
микроиньекцияланған  эмбриондарды  реципиенттің  көбею  жолына 
отырғызғаннан  кейін  кемінде  100  буаздықтың  шақырылуы  қажет 
болды.
Үй  жануарларының  ішіндегі  ірі  малдарды  микроиньекциялау 
тиімділігінің  төмендігі  жэне  көп  малды  ұстап  тұрудың  қымбатқа 
түсетіндіктері,  зерттеушілерді  трансгенозды  пайдалануды  арттыру 
үшін басқа да жолдарын қарастыруға итермеледі.
Микроиньекция  тиімділігін  артгырудың  осындай  тэсілдердің 
бірі  -   реципиентке  отырғызғанға  дейін  гендердің  эмбрионға 
интеграцияланғанын 
анықтап 
білу 
болатын. 
Эмбрионда 
иньекцияланған  ДНҚ-ның  бар  екендігін  олардың  ерте  кезеңдік 
даму мерзімдерінде ПЦР арқылы анықтауға болады деп есептелінді 
(Ninomija Т жэне басқалары.,  1989). Алайда ДНҚ-ның жаңа геномға 
бірден  интеграциялана  қоймауы  (бірнеше  күн  өтеді)  себепті,  бұл 
қондырғы арқылы шынымен трансгенді эмбрионды аныктау мүмкін 
болмады.
Басқа  бір  жолы,  барлық  гендер  жиынтығымен  қоса  геномға
интеграцияланады 
деп 
есептелінетін 
репортерлі 
гендердің 
белсенділіктерін  аныктауга  негізделді.  Бұлардың  біреулері  анти- 
биотиктерге  тұрақтылығына  сүйенсе  (Bondioli  К.  жэне  басқалары., 
1996),  басқалары  люцифераза  (Menck  М.  С.  жэне  әріптестері, 
1998;  Nakamura  А.  және  басқалары.,  1989)  не  болмаса  жасыл
флюорисцирлейтін ақуыздардың (GFP) белсенділігі арқылы аныктау 
көзделінді. Бүл акуызды анықтау оңай болганымен, оның экспрессия-
55

сы  интеграцияланған  ДНҚ-мен  шектелмеуі  сеоепті,  реакцияның оң 
және теріс кездерінде де көрініс бере алады.
Трансфицирленген 
ядроны 
тасымалдап 
отыргьізуда
 

 
трансгенді  интеграциялау  арқылы  таңдап  алынатын  жасуша  ядро­
сы  пайдаланылатындықтан,  тек  қана  трансгенді  эмбриондарды 
отырғызуға мүмкіндік береді.  Сол  себепті,  осындай  құрастырылған 
эмбриондарды  тасымалдау  нәтижесінде  туылған  әрбір  урішқ 
трансгенді  болады  және  ары  қарай  трансгенді  эмбриондарға 
сұрыптау жұмыстарын жүргізудің қажеттілігі болмаиды.
Ұ р ы қталм аған
ооциттөр
Ж ас у ш а   культурасы
Ұ р ы қ та л м а ға н
о о ц и ттер
О оциттөрді 
ұ р ы қтан д ы р у  мөн
э м б р и о н д а р д ы   in
vitro өсіру
Т р а н с ф е к ц и я  ж эн е 
сұ р ы п тау
Морула 
қабығының 
астына не 
болмаса 
бластоцельге 
ДІРУ
О о ц и тте р
эн у к л е а ц и я с ы
Э н у к л еа ц и я л ан ған
ооцит
Ж асу ш а 
сусп ен зи ясы
Қ аб ы қш а 
а с т ы н а   ендіру
ж эн е  электро- 
қосы лд ы ру
ф   in vitro ө сір у  (6-7 күн)
Р ец еп и н тк е оты рғы зу
Р ө ц и п и н тке
т а с ы м а л д а у
х
S
Х имирлі х а й у а н д а р
*
V  
А
*
Т р ан сген д і х а й у а н д а р
Трансгөнді  х а й у а н д а р
13-сурет. In vitro жағдайында өсірілген трансформацияланған жасушалар­
ды қолдану арқылы трансгенді жануарлар алу нұсқасы
Трансфицирленген ядроны тасымалдау геномның спецификалық 
аймағына  тікелей  интенграциялау  мүмкіндігін  де  береді.  Микро- 
иньекциялау барысында трансгендер геномның кез келген аймағына 
интеграцияланады.  Бұл  дегеніміз,  олардың  эжептеуір  гендерді
56

бұза  алатындықтарын,  не  болмаса  трансьсрипциялау  жэне  транс- 
ляциялау  үшін  жеткізе  бермейтін  хромосомдар  үлескелеріне 
орналасатындықтарын  жэне  ешқашан  экспрессияланбайтындарын 
көрсетеді.  Екінші жағынан,  микроиньекциялану нэтижесінде пайда 
болған жаңа құрылымдар тек жаңа материалдар көзі болатындықтан, 
геномда  бар  мәліметтерге  қосымша  ретінде  қарастырыла  ала­
ды.  Егер  қандай  да  бір  эндогенді  геннің  белсенділігіне  кедергі 
келтіру  мақсаты  қойылатын  болса,  онда  ол  РНҚ-ның  не  болмаса 
рибозимдардың антимағыналық бейтараптандыру  қабілеттіліктерін 
пайдалану стратегиялары арқылы жүзеге асырылады.
Ядроны отырғызу тышқандағы эндогенді гендердің белсенділігін 
жою  мысалынан  басқа,  «Knock-out»  стратегиясындағы  барлық 
артықшылықтардан  пайда  беруі  мүмкін.  «Knock-out»  стратегия- 
сын  қолдану  ірі  жануарларда элі  жүргізілген жоқ.  Алайда,  басқа да 
жануарларда  өзгертілген  (трансформацияланған)  плюропотентті 
жасушалық желілерді алу мүмкін деп есептелінеді жэне ол тек қана 
болашақтың үлесіне тиеді.
2.3.1.1 Ретровирусты векторларды қолдану
Жануарлардың  эмбрионалды  желісіне  бөгде  ДНҚ  ендірудің 
тиімді  тэсілі  ретінде  ретровирусты  инфекцияны  қолдануцы  айтуға
болады.
Retroviridae
  туыстарына  (лат.  retro  -   кері)  -   қүрамында  ви- 
рионды  РНҚ матрицасында ДНҚ синтезін  қамтамасыз  ететін  РНҚ- 
тэуелді  ДНҚ-полимеразасы  (кері  транскриптаза)  бар  рибонуклеин 
қышқылды вирустардың үлкен тобы жатады. Ретровирус вирионда- 
ры  диаметрі  70-120  нм  көлеміндегі  шар  тэрізді  болып  келеді  жэне 
қүрамы  бойынша  өзекшеден,  ішкі  ақуыздық  жарғақшадан  жэне 
бетінде  үзындығы 
8
  нм  болатын  төмпешіктері  бар  липопротеидтік 
сыргқы  қабықшадан  түрады.  Өзекшеде  икосаидрикалық  (икоса- 
идрической)  пішінді  ішкі  капсула  мен  вирионның  дэл  ортасын- 
да  орналасқан  (С  типті  вириондар)  рибонуклеопротеид  пішіндес 
көлемі 5-10 т.п.н.  шамасындағы геномды РНҚ-ның екі көшірмесі не 
болмаса эксцентрикалы  жайғасқан  (В  және  D типті  вириондар)  бо­
лады.  Вирустың  сыртқы  қабаты  қысқа  гликопротеидтерден  тұрады 
жэне жасуша иесінің цитоплазмалық жарғақшасының бөлікшесі бо- 
льш келеді (
14-сурет
).
57

Липидтердің екі қабаты 
(иесінің жасуша 
жарәақшасынан құралады)
Капсид ақуызы
Виральды қабаттаәы 
гликопротеидтер (env)
Реверсиөті
транскриптаза
14-сурет. 
Ретровирустың сызбанұсқасы
Эндогенді  вирустар  хромосома  элементтері  болып  табыла- 
ды  жэне  адам  геномындағы  ДНҚ-ның  1%  дейін  құрайды  (Tarusio, 
Montovani,  1998).  Эндогенді ретровирустардың ретроэлементтердің 
өзгешелеу түрлері екендігі жэне оған сүтқоректілер геномының 
10
%
деиін жататыны анықталған.
Ретровирус  геномы  кейіннен  гендер  деп  аталып  кеткен  үш  код- 
таушы  аймақтардан тұрады. 
Gag
 гені  капсид пен  вирус  қабығының 
ақуызын  коделесе, 
роі
  -   вирустық  реверсивті  транскриптаза 
жэне  вируспен  байланысты  басқа  да  нуклеазаларды,  ал 
env
  гені
—  вирустың  липидтік  қабығындағы  гликопротеидтерді  коделейді. 
Ретровирустардың  геномдық  РНҚ  ұштары  ұзындығы  10-нан  80 
нуклеотидтерге  дейін  тұратын  R-сегменттерінің  қайталанымды 
тіркестерінен  тұрады.  R-сегментінің  геномдық  РНҚ-ның  3' 
ұшында ұзындығы  170-1250  нуклеотидтерден  тұратын U3  аймағы, 
ал  R-сегменттің  5'  ұшында  ұзындыгы  80-100  нуклеотидтерден 
кұралған U5 аймағы орналасады. 


f '
Вирустық РНҚ геномының сызықтық ДНҚ көшірмесінің түзілуі 
барысында  молекула  ұштарында  келесі 
өзгерістер  жүреді: 
5' 
ұшында U3  аймағының  сегменті,  ал  3'  үшында -  U5  аймағы  орна­
ласады.  Жаңадан  пайда  болған  қүрылым  U3-  R-  U5  түрінде  бола­
ды. Ретровирустың ДНҚ пішініне тэн осындай үлескелер LTR үзын 
ұштық қайталымы деген атқа ие болды.  5'  үшында орналасқан LTR
58

өте күшті промоторлы келсе, ал 3'  ұшында орналасқан LTR-да РНҚ 
полиаденилирленуге  жауапты  белгі  орналасады.  LTR  провирустың 
жаңа  ие  ағзасы ДНҚ-на интеграциялануы  жэне  вирустық  РНҚ-ның 
провирустық матрицаға транскрипциялануы үшін кажет 
(15-сурет).
U3 

U5
U3 
R  U5
ро!
ШЯШІШ
LT
Энхансер
Кэн-сайт
ЦЦАА Т 
ТАА ТА
15-сурет. 
Ретровирус геномының екі үзікті 
ДНҚ 
формасының құрылымы
(Ibelgaufts
 бойынша,  1990)
Ретровирустың  репликациясы  мен  оларды  трансгенді  жануар­
ларды алуда қолдану механизмін түсіну мақсатында, ретровирустың 
тіршілік кезеңін қарастырайық (no Salmons et al.,  1991).
Ретровирустың жасушаға енуінің бастамасы оның жасуша мем- 
бранасымен  жанаса  отырып  арнайы  рецепторлық  ақуызы  арқылы 
env
  ақуызын  байлауынан  басталады  (
16-сурет
).  Вирустың  адсорб- 
циялануынан  кейін,  жасуша  мембранасында  РНҚ-ны  “шешіндіру” 
жэне  оның  вирустың  ішкі  ақуыздарымен  бірге  жасуша  ішіне  енуі
басталады.
Одан  кейін  цитоплазмаға  енген  вирустық  ДНҚ-да  кері  транс­
крипция  көмегімен  екі  үзікті  ДНҚ-көшірмесі  синтезделеді.  Транс- 
крипциялану  нэтижесінде  ретровирустың  5'  және  3'  ұшында  түзу 
ұзын  ұштық  қайталымы  U3-  R-  U5,  яғни  LTR  деп  белгіленетін 
қайталанымдар  дупликациясы  жүреді.  Осындай  ДНҚ  молекуласы 
интеграция  басталғанға дейін жасуша ядросында өзінше жазықтық 
не  болмаса шиыршықты түрде  болады.  Интеграциялану үдерісі  ба- 
рысында  ДНҚ  көшірмесінің  екі  ұштарындағы  2  жұп  негіздерінің 
ажырауы жэне иегер жасушасы ДНҚтізбегіндегі 4-6 жұп негіздерінің 
еселенуі жүреді.  Вирус геномыныц ағза иесі ДНҚ-на интеграцияла­
нуы арқылы тіршілігін жалғастыруы -  
провирус
 деген атқа ие болды.
59

РЕТРОВИРУСТЫ  ИНФЕКЦИЯ
4
16-сурет. Ретровирустардың тіршілік кезеңдері
ірансгенді  жануарлар  алу  үшін  ретровирусты  векторлар- 
ды  пайдаланудың  басты  артықшылығы  ретінде  -   осы  мақсатта 
пайдаланылған  эмбриондардың 
100
%  ретровируспен  инфекцияла- 
нуын айтуға болады.
Ретровирусты  векторларды  пайдаланудың  негізгі  кемшіліктері
ретінде  -   олардың  шектеулі  көлемінің  (екпе  көлемінің 
8
  мың  п.н.
аспауы  қажет)  қолданылуы,  спайслинг  нәтижесінде  ретровирус-
тан  интрондық  қатарлардың  қиылуы,  олардың  титрінің  төмендігін 
айтуға болады.
6 0

Chan A. W. S. жэне басқаларының (1998) тәжірибелерінде ооцит- 
ке  тікелей  ретровирус  векторлы  генді  ендіру  арқылы  трансгенді 
бұзаулар  альгаған.  Ретровирусты  вектордағы  трансген  көлемінің 
шағын болуы себепті бұл жүйені пайдалану мүмкіндігі шектеулі бо- 
луына қарамастан, ең болмағанда in vitro жағдайында ұрықтандыруға 
болатын жануарлар үшін қолдануға балама эдіс деп қарастырылады.
Экзогенді ДНҚ векторы ретінде сперматозоидтарды  пайдала­
ну
 мүмкіндігі бойынша соңғы кездерге дейін қарама-қайшы пікірлер 
мен  күмэңді  мәліметтер  бар  (Gandolfi.  F.  жэне  басқалары.,  1998). 
Осы мәселе бойынша бір  нұсқаны пайдалана отырып, эртүрлі зерт- 
ханаларда да, бір зертханада да жүргізілген зерттеулер (Маіоге жэне 
басқалары.,  1998) түрлі нәтижелер көрсеткен.
Трансгенді  жануарлар  алуда  сперматозоидтар  аталықтың 
жалғыз  ғана дернәсілдік  жасушалары  болып табылмайтындықтары
анықгалған.  Brinster  жэне  т.б.  (1994)  аталықтан  алынған  спер­
ма  өнімдерін  (сперматогониялар)  сол  не  болмаса  басқа  тұқымды 
малдарға  отьфғызуға  болатындықтарын  жэне  олардың  өз  қызмет- 
терін  атқара  беретіндіктерін  анықтаған.  Бұл  дегеніміз  басқа 
аталықтың  жыныс  жұмыртқасына  (енегіне)  апарып  отырғызғанға 
дейін  экзогенді  гендерді  осы  жасушаларға  (сперма  өнімдеріне) 
енгізуге  мүмкіндік  беретіндігін  көрсетеді.  Тірі  малдың  енектеріне 
ДНҚ-ын тікелей иньекциялау арқылы аталықтардың дернәсілдік (за­
родыш)  жасушалары желісін 
in situ
 жағдайында трансформациялау 
жөніндегі жұмыстар бірнеше ғалымдар (J.  -Н. Kim жэне басқалары,
1997)  тарапынан  мэлімделген  болатьш.  Бұл  эдісті  пайдалану  ұрық 
шығару  түтікшесіне  сперматозоидтарды  отырғызу  техникалық 
тұрғыдан мүмкін емес жануарлар үшін қызығушылық тудырады.
Соңғы  кездері  енек  діңгек  жасушасынан  алынған  спермато- 
гония  жасушаларымен  жасалатын  манипуляциялар  белгілі  бір 
қызығушьшықгар  тудыруда.  Атап  айтқанда  бір  түрге  жататын  жа- 
нуарлардан  (тышқан)  алынған  сперматогониялармен  қатар,  эртүрлі 
жануарлардың  (тышқан-атжалман)  сперматогонияларын  бір-біріне 
тасымалдау мүмкін екендігі анықталған (
Brinster, Avarbock,  1994).
Спермияларды 
вектор 
ретінде 
пайдаланудың 
бірнеше
басымдықтары бар:
1.  Ағза  геномына  интеграцияланған  бөгде  ДНҚ  („ДНҚ)  кейінгі 
ұрпақтарына тұрақты түрде беріле алады.
2. Жануарлардың генотипі мен фенотипін өзгертуі мүмкін.
61

3
. Ұрпақтарын алу мерзімі қысқарады.
4.  Трансгенді  жануарлар  тобын  жасақтау  жұмыстарының  құны 
төмендейді. 
!  ' 
• = 
ЩР
Алайда  трансгенді  жануарлар  алуда  ұрық  жасушаларын  паи- 
далану  мэселесі  “трансгенді”  спермнялардағы  физиологиялық 
қызметтерінің  бұзылуы  (қозғалысының  бәсеңдеуі,  цитоплазмалық 
мембранасының бұзылуы,  акромосомиялық ауытқушылықтың  пай­
да  болуы,  ұрықтандыру  қабілетінің  жойылуы)  жэне  “трансгенді” 
мен  қалыпты  спермияларды детекциялау мен  бөліп  алудың күрделі 
болуы себептерінен қиындай түседі. Жоғарыда аталған кедергілерді 
жою  трансгенді  жануарлар  алудың  қарапайым  жэне  ыңғайлы
эдісіне  қол  жеткізуге  мүмкіндік  оереді,  өиткені  қазірп  кезде  ауыл 
шаруашылық жануарларын қолдан ұрықтандыру жұмыстары жақсы
жолға қоиылған.
2.3.2 Сомалық (денелік) трансгенді жануарлар алу және олардың 
рекомбинантты ақуыз прдуценттері ретіндегі маңызы
Алдыңғы 
«Мал  шаруашылыгында  қолданылатын  трансгенді 
технологиялар
»  тақырыбында  трансгеннің  ағзадағы  тұрақтануына 
(орын тебуіне)  байланысты трансгенді  жануарлар  генеративті  және 
денелік  (сомалық)  трансгенді  жануарлар  деп  бөлінетіні  жөнінде 
айтылған  еді.  Генеративтік  трансгенез  жұмыстарының  атқарылуы 
алдыңғы тақырыптарда берілді. Енді денелік (сомалық) жасушаларға 
кажетті  гендер  конструкциясын  ендіру  арқылы  трансгенді  жануар­
лар алу эдісіне тереңірек тоқталайық.
Қазіргі  кезде  ауыл  шаруашылық  жануарлары  сүтіне  рекомби­
нантты  ақуызды  бағытты  түрде  экспрессиялауда  келесідей  денелік 
(сомалық) трансгенез эдістерін кеңінен қолдану қарастырылуда:
•  «жалаңаш» ДНҚ пайдалану
•  миююбөлш ектепі мен  бомбя nav 
ретровирустар
аденовирустар
•  липосомаға орап тасымалдау
•  рецепторлы-орталы гендер тасымалы

Бұл әдістердің әрқайсысының басымдықтары да, кемшіліктері де 
бар.  Мысалы,  “жалаңаш”  ДНҚ пайдалану  көп  жағдайларда тиімсіз 
келеді. Микробөлшектермен бомбалау мен  электропорация әдістері 
үшін  қымбат  құралдар  қажет,  сонымен  қатар  олар  жасуша геномы- 
на ендірілген  рекомбинантты гендердің тұрақты  интеграциялануын 
қамтамасыз  ете  алмайтындықтан,  трансгендердің  салыстырмалы 
түрде қысқа мерзімдік жэне томен дәрежелі экспрессиясын тудыра-
ды.
Электропорация  әдісі  жоғары  кернеулі  электр  импульсінің 
биожарғақша  (биомембрана)  откізгіштігін  арттыруына  негізделген. 
Ол үшін  жасушаға ендіруте  арналған ДНҚ бөлшектерін  электропо­
рация жасайтын сұйықтыққа салады  (7 
7-сурет).
  Сұйықтық арқылы 
жоғары кернеулі электр импульсін өткізген кезде (кернеу 200-350 В, 
импульс  ұзақгығы  54  мс)  цитоплазмалық  мембранада  ДНҚ  макро- 
молекулалары сыйып кететіндей саңылаулар пайда болып, осмостық 
қысым арқылы олар (ДНҚ) сырттан ішке қарай өтеді. Осы кезде жа­
суша көлемінің артқаны байқалады.
Электропорация  карапайым  физикалық  эсер  арқылы  жүзеге 
асыруға  негізделгендіктен,  басқа  әдістерге,  мысалы,  биохимиялық 
эдіске қарағанда кең қолданыс тапқан. Көптеген зерттеулер нәтижесі 
электропорация  эдісі  арқылы  ДНҚ  молекуласының  жануарлар, 
қарапайымдылар,  ашытқылар,  бактериялар  мен  өсімдік  протопла- 
стары  сияқты  эртүрлі  жасуша  типтеріне  ендіруге  болатындығын
көрсеткен.
ДНҚ ерітіндісі 
Электрод 
Электрод
ш  
W
  ,   1

1   2   3   4   5   6   7   8   9


©emirb.org 2017
әкімшілігінің қараңыз

войти | регистрация
    Басты бет


загрузить материал